Гуанидиннуклеотидсвязывающие регуляторные белки, или G– белки, ответственны за передачу сигналов множества гормонов или нейромедиаторов к разнообразным мишеням клетки. ЧетыреG– белка были очищены до гомогенного состояния и биохимически охарактеризованы:G t (трансдуцин),G s ,G i иG o . Оказалось, что каждый из них имеет уникальные мишени или эффекторные белки.G t активирует сGMP– специфическую фосфодиэстеразу в наружных сегментах палочек сетчатки;G s иG i соответственно стимулируют и ингибируют аденилатциклазу и присутствуют во всех клетках;G o представлен в большом количестве в клетках мозга и, по – видимому, ингибирует электрочувствительный Са 2+ - канал в нейронах. Кроме того, почти, несомненно, имеются и другие пока не выделенныеG– белки.G– белокG p , вероятно, использует в качестве мишени фосфатидилионозитолспецифичную фосфолипазу С, которая инициирует быстрый распад фосфатидилинозиола в плазматической мембране и образование нескольких вторичных посредников. Существует белокG k , который, по – видимому, открывает К + - специфические каналы в сердечной мышце и в других клетках.G– белки внутри клетки могут отвечать на связывание лиганда с одним из нескольких рецепторов. Они могут иметь больше одной мишени.

Все четыре выделенных белка являются αβγ – гетеротримерами. У них довольно большие различия между субъединицами. Имеются, например, три α – субъединицы. β – субъединиц пока известно, как минимум 2. Имеются также сведения, что существенные различия обнаружены и в γ – субъединицах. α – субъединицы связывают GTPи обладаютGTPазной активностью при отсоединении от βγ – субъединичной пары. α - Субъединица также содержит сайт, по которому может происходить АDP– рибозилирование бактериальными экзотоксинами.G i ,G o иG t (трансдуцин) модифицируются коклюшным токсином, аG s иG t – холерным токсином. Эта ковалентная модификация блокирует фосфорилированиеG– белка и служит одним из тестов на участиеG– белков в качестве интермедиатов в клеточных ответах.

Все G– белки прочно связаны с плазматической мембраной, за исключением трансдуцина. Ни одна из субъединиц не является трансмембранным белком.

Обновление фосфатидилинозитола и вторичные посредники

Наиболее широкораспрастранёнными мишенями G– белков являются аденилатциклаза (дляG s иG i) и фосфолипаза С, ответственная за гидролиз фосфатидилинозитола (дляG p). Модуляция аденилатциклазы приводит к изменению внутриклеточной концентрации сАМР, которая, как известна, служит вторичным посредником, влияя на множество внутриклеточных процессов. Одним из последствий увеличения содержания сАМР является, например, стимуляция сАМР – зависимой протеинкиназы (протеинкиназа А), которая в свою очередь фосфорилирует специфические белковые субстраты. Клетки содержат также два типа Са 2+ - зависимых протеинкиназ, активируемых соответственно Са 2+ - кальмодулином и Са 2+ вместе с диацилглицеролом и фомфатидилсерином (протеинкиназаС). Активность обоих киназ регулируется вторичными посредниками, образующими при деградации фосфатидилинозитола, которая во многих клетках инициируется путемG– белокзависимой активации специфической фосфолипазы С.

На долю фосфатидилинозитола приходится лишь 2 – 8% всех фосфолипидов, содержащихся в клеточных мембранах эукариотов. Структура полярной головки представлена миоинозитолом. Данное соединение впервые было выделено из мышц. Небольшая часть фосфотидилинозитола фосфорилирована по положению 4 или по положениям 4 и 5. От 1 до 10% фосфатидилинозитола, присутствующего в мембране, приходится на долю фосфотидилинозитол(4,5) – бифосфата. Этот компонент является, вероятно, первой мишенью для фосфотидилинозитолспецифичной фосфолипазы С, которая активируется во многих клетках G– белком. Последующий гидролиз приводит к быстрому распаду фосфатидилинозитола в плазматической мембране и кратковременному возрастанию количества продуктов распада. Продукты распада действуют как вторичные посредники и участвуют во многих клеточных процессах. Исследование этой системы ещё не закончено, но последовательность событий такова:

Начальными продуктами гидролиза фосфотидилинозитол(4,5) – бифосфата являются диацилглицерол и инозитол (1,4,5) – трифосфат. Диацилглицерол связан с мембраной, а инозитол(1,4,5) – трифосфат является растворимым компонентом. Обычно жирные кислоты фосфотидилинозитола представлены стеариновой в положении 2 и арахидоновой кислотой в положении 2 глицерола.

Инозитол(1,4,5) – трифосфат служит вторичным посредником, и его основной функцией, по – видимому, является мобилизация Са 2+ , аккумулированного в эндоплазматическом ретикулуме. Возможно, этот компонент путём прямого связывания открывает Са 2+ - специфичные каналы в ЭПР, что приводит к увеличению концентрации Са 2+ в цитоплазме в несколько раз. Обычно концентрация свободного кальция в цитоплазме составляет 0,1 мкМ.

Специфичная киназа превращает некоторое количество инозитол(1,4,5) – трифосфата в тетрафосфорилированный продукт (инозитол(1,3,4,5) – тетрафосфат). Образуются также другие, в том числе циклические фосфоинозиды, и некоторые из них имеют определённое физиологическое значение.

Одним из ферментов, регулируемых Са 2+ , является фосфолипаза С, которая при низкой концентрации кальция использует в качестве субстрата фосфотидилинозитол(4,5) – бифосфат, но при более высокой концентрации кальция использует нефосфорилированный фосфатидилинозитол. Возможно, это облегчает непосредственный быстрый гидролиз основной части фосфатидилинозитола.

Наиболее важным ферментом является протеинкиназа С. этот фермент локализован преимущественно в цитозоле до момента появления там диацилглицерола и Са 2+ . Затем в зависимости от присутствия фосфотидилсерина он связывается с плазматической мембраной и активируется. Эффекты сходные с действием диацилглицерола, оказывают форболовые эфиры, и протеинкиназу С часто рассматривают как рецептор этих соединений. В активированном состоянии протеинкиназа С является серин – и треонинспецифичной протеинкиназой, которая фосфорилирует как специфические мишени, так и саму себя. Механизм регуляции работы протеинкиназы С неизвестен; установлено лишь, что ганглиозиды и лизосфинголипиды ингибируют этот фермент, а, кроме того, ещё и выделен ингибитор белковой природы.

Дацилглицерол может подвергаться дальнейшей деградации под действием диацилглицероллипазы до арахидоновой кислоты, которая окисляется до множества биологически активных метаболитов, называемых эйкозаноидами и включающих простагландины. Хотя сама арахидоновая кислота является вторичным посредником, неясно, насколько существенен для её образования фосотидилинозитолспецифичный, зависимый от фосфолипазы С путь. Арахидоновая кислота может образовываться из множества фосфолипидов при действии фосфолипазы А 2 . В некоторых типах клеток путь биосинтеза с участием фосфолипазы А 2 более важен.

Исходя из вышесказанного, можно утверждать, что при функционировании этой системы образуются, по меньшей мере, три известных вторичных посредника: диацилглицерол, инозитол(1,4,5) – трифосфат и арахидоновая кислота. Каждый из этих посредников выполняет специфические функции, включая увеличение содержания внутриклеточного кальция и активацию кальций – зависимых протеинкиназ.

G – белки усиливают передаваемый сигнал. Например, передатчик нервного импульса норэпинефрин может взаимодействовать со своим мембранным рецептором всего несколько милисекунд. G – белок увеличивает длительность действия сигнала с милисекунд до десятков секунд, что чрезвычайно важно (не нужно постоянно посылать сигналы нервной системе). Происходит экономия нервной энергии.

Рецепторы, сопряженные с G – белками образуют семейство “серпантинных” (или змеиных) рецепторов, называемых так потому, что их полипептидные цепи пересекают плазматическую мембрану 7 раз.

К этому семейству принадлежат рецепторы для адренергических аминов, серотонина, ацетилхолина (мускариновые), многих пептидных гормонов, обонятельного эпителия, зрительных рецепторов (в колбочках и палочках сетчатки). Информационная молекула (например, норэпинефрин) связывается с «карманом», образованным трансмембранными областями рецептора. Возникшие изменения конформации этих участков передаются цитоплазматическим петлям рецептора, которые активируют G-белок. Чем больше молекул агониста, тем больше скорость его связывания с рецептором.

Десенситизация рецепторов.

Это означает, что после достижения начального высокого уровня эффекта (например, накопление внутриклеточного цАМФ, ток Na + , сокращение мышцы и т.д.) ответ клетки постепенно уменьшается в течение секунд или минут, даже не смотря на постоянное присутствие сигнальной молекулы. Десенситизация обратима. Так, через 15 минут после удаления сигнальной молекулы, его повторное воздействие ведет к реакции, сравнимой по величине с начальной.

Down – регуляция рецепторов.

Рецептор, при его чрезмерной стимуляции, может погружаться в цитозоль и клетка с помощью лизосомальных ферментов «переваривает» его до аминокислот. Мембрана, где был рецептор, восстанавливается.

Ар – регуляция.

Если хирургически перерезать нервы, иннервирующие мышцу, то мышца не получит сигнал из нервной системы и не может сократиться. Реакция мышцы на денервацию направлена на синтез дополнительных рецепторов. Они синтезируются и встраиваются в наружную клеточную мембрану. Клетка хочет получить сигнал на сокращение. Сигнал не поступает (нерв перерезан), хотя рецепторов много и они особенно восприимчивы к нейромедиатору. Рецепторы располагаются даже в других местах, вдали от места соединения нерва с мышцей. Это и есть так называемая Ар – регуляция рецепторов – синтез новых рецепторов клеткой и встраивание их в мембрану. Рецепторы постоянно обновляются. Срок жизни рецептора – несколько дней. Взамен состарившемуся и разрушенному клеткой, она строит новый. Это динамичный процесс.

Таким образом, встроенный в мембрану рецептор принимает сигнал (нервный импульс, гормон лекарства), G-белок усиливает этот сигнал. Эффекторный элемент (фермент) реализует этот сигнал, запуская синтез в клетке вторичных посредников. Они изменяют скорость протекания биохимических реакций в клетках и непосредственно реализуют сигнал, посылаемый нервной или гормональной системой.

Вторичные посредники.

1) цАМФ. участвует в передаче таких гормональных эффектов, как: 1) мобилизация энергетических запасов (распад углеводов в печени или триглицеридов в жировых клетках – эффекты катехоламинов – (эпинефрин, изопреналин).

2) задержка воды почками – эффекты вазопресина;

3) поддержание Са +2 гомеостаза – эффекты гормонов паращитовидных желез;

4) увеличение частоты и силы сокращений сердечной мышцы – эффекты катехоламинов (эпинефрин, изопреналин)

5) регуляция биосинтеза стероидов в надпочечниках и половых железах – эффекты кортикотропина или фолликулостимулирующего гомона;

6) – расслабление гладких мышц и многие другие гормональные и нервные процессы.

Когда нервный или гормональный стимул завершается, внутриклеточные эффекты цАМФ прекращаются путем активации фермента разрушающего цАМФ.

Одним из механизмов лечебного действия кофеина , теофиллина и других метилксантинов является ингибирование распада цАМФ.

2) Са +2 и фосфоинозитиды.

Некоторые гормоны, нейромедиаторы и факторы роста связываются с рецептором на поверхности эффекторной клетки. Сигнал передается на G-белок. В последующем происходит активация фосфолипазы С. Последняя специфически расщепляет фосфолипиды плазматической мембраны с образованием двух вторичных посредников: 1) диацилглицерола , 2) инозитолтрифосфата .

Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует ферменты и изменяет их активность.

Инозитолтрифосфат высвобождает Са 2+ из внутриклеточных хранилищ (саркоплазматический ретикулум, митохондрии). Са 2+ изменяет функции клетки. Например провоцирует сокращение мышцы и т.д.).

Через фосфоинозитиды действует литий, используемый для лечения маниакально-депрессивных состояний.

3) цГМФ . В отличие от цАМФ, участвует в передаче сигналов лишь в некоторых типах клеток. В слизистой кишечника и гладких мышцах сосудов функционирует параллельно с цАМФ-системой (как запасной). Механизм действия цГМФ также опосредован фосфорилированием белков.

Повышенная концентрация цГМФ вызывает расслабление гладкой мускулатуры сосудов за счет дефосфорилирования легких цепей миозина.

Фосфорилирование: общий механизм.

Почти все механизмы передачи сигнала с помощью вторичных посредников обусловлены фосфорилированием.

В процессе эволюции организм не выработал специальные рецепторы для лекарств. Они действуют через рецепторы для нейромедиаторов и гормонов. Почти все лекарства (исключение составляют, пожалуй, лишь средства для общей анестезии) оказывают свое действие через рецепторы.

Мы детально рассмотрели рецепторы, встроенные в плазматическую мембрану клетки. Но есть и другие рецепторы лекарств. В принципе рецептор – это то, с чем лекарство связывается (взаимодействует) в организме. Например, альбумин – рецептор для лекарств, которые связываются с ним. Но этот рецептор не активный, не приводящий к возникновению фармакологического эффекта.

К другим классам рецепторов лекарств относятся:

1) ферменты, 2) транспортные белки, 3) структурные белки.

При связывании с лекарствами они могут ингибироваться или (реже) активироваться. Например, дигидрофолатредуктаза – рецептор для метотрексата.

Транспортные белки (например, мембранный рецептор для сердечных гликозидов – Nа + , К + , АТФаза).

Структурные белки (например, тубулин – рецептор для противовоспалительного средства колхицина) .

В каждом случае взаимодействия лекарства с рецептором образуется лекарственно-рецепторный комплекс, приводящий к изменению метаболизма в клетке и органе. Развивается фармакологический эффект. Его величина пропорциональна количеству лекарственно-рецепторных комплексов.

Лекарства, действие которых связано с возбуждением рецепторов называют агонистами . Агонисты бывают: 1) полные (вызывают максимальный ответ) и 2) частичные. Последние связываются с рецепторами и возбуждают их. Но фармакологический эффект слабее, чем от природного регулятора. Вещества, препятствующие действию специфических агонистов называются антагонистами (блокаторами).

Рецепторы классифицируют по их чувствительности к естественным медиаторам и к их антагонистам. Например, чувствительные к ацетилхолину рецепторы называют холинэргическими, чувствительные к эпинефрину (адреналину) – адренергическими.

Для возбуждения рецепторов и получения соответствующего эффекта используют как сами медиаторы (норэпинефрин, дофамин и другие), так и лекарства, обладающие сродством к рецепторам. Чаще всего последние являются структурными аналогами медиаторов.

Некоторые вещества возбуждают соответствующий рецептор не путем непосредственного взаимодействия с ним, а за счет освобождения медиаторов из связанной (физиологически неактивной) формы или путем угнетения ферментов, разрушающих медиаторы.

Рецепторы занимают небольшую часть наружной клеточной мембраны. Так, участки мембраны, реагирующие на ацетилхолин, составляют только 1/6000 часть общей поверхности клетки

2. ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ. Действие некоторых лекарств основано на активации или ингибировании ферментов. Например, ФИЗОСТИГМИН угнетает активность холинэстеразы, разрушающей ацетилхолин. Он вызывает эффекты, характерные для возбуждения парасимпатической нервной системы.

Некоторые лекарства способны вызывать индукцию, то есть увеличивать содержание ферментного белка. При этом возрастает их активность. Например, фенобарбитал, повышая активность УДФ-глюкуронилтрансферазы снижают гипербилирубинемию.

3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА МЕМБРАНЫ КЛЕТОК .

Для некоторых лекарств природа молекул-мишеней неизвестна. Их действие не связано со специфическими рецепторами. Например, средства для общей анестезии действуют, изменяя транспорт ионов. Лечебный эффект мазей, присыпок, жидких мазей имеет физическую природу. Они предохраняют пораженные участки кожи или слизистых оболочек от раздражения.

Большинство рецепторов относятся к семейству семикратно пересекающих мембрану серпентиновых (змееподобных) рецепторов. Эти рецепторы выполняют разнообразные биологические сигнальные функции. К ним относятся рецепторы вкусовых клеток. Сотни различных разновидностей рецепторов, находящихся на клетках обонятельных луковиц нашего носа передают информацию относительно присутствия лигандов-ароматов. Серпентиновые рецепторы имеют очень древнее происхождение. Их используют, например, клетки дрожжей, которые выделяют необходимые для спаривания полипептидные факторы и распознают их с помощью поверхностных рецепторов, представляющих собой все те же семикратно пересекающие мембрану серпентиновые рецепторы. Уникальная структура лиганд-связывающих участков серпентиновых рецепторов позволяет связывать лиганды различной природы и молекулярной массы.

Существуют сотни различных форм G-белковых рецепторов, а химическое разнообразие их лигандов чрезвычайно велико. Высокоспецифичные рецепторы этого семейства реагируют на :

ü небольшие молекулы, такие как катехоламины, пептиды и хемокины;

ü высокомолекулярные соединения, такие как гликопротеиновые гормоны;

ü тромбин;

ü световые импульсы;

ü летучие пахучие вещества.

Хотя общее строение G-белков одинаково, выявлены важные различия :

Ø различное расположение этих белков в липидном бислое;

Ø различия пространственной структуры рецепторов, что объясняет наличие различных
участков связывания и специфичность этих молекул.

Рисунок 8 иллюстрирует некоторые структурные различия рецепторов, сцепленных с G-белком, и объясняет широкую лигандную специфичность белков этого класса.

К началу 90-х годов было выделено более ста таких рецепторов, сопряженных с G-белком. К этому суперсемейству относятся рецепторы катехоламинов, ацетилхолина, серотонина, гистамина, ангиотензинов и др.

Они образуют суперсемейство интегральных белков длиной 400-600 аминокислот. В составе цепочки имеются 7 высококонсервативных участков , образованных 22-28 гидрофобными аминокислотами (рис.9 и рис. 10). Данные гидрофобные участки образуют, вероятно, альфа-спирали и 7 раз прошивают плазматическую мембрану. Они разделены крупными гидрофильными сегментами, обращенными наружу и внутрь клетки. N-конец молекулы рецептора расположен во внеклеточном пространстве и имеет участки, по которым происходит N-гликозилирование. Предполагается, что сахарные участки участвуют в прикреплении N-конца рецептора к мембране. На C-концевом фрагменте, обращенном внутрь клетки , имеются участки, по которым может происходить фосфорилирование цАМФ-зависимой ГТФазы . Участок взаимодействия с ГТФ-связывающим белком находится в третьей цитоплазматической петле.

Отличительными структурными чертами серпентиновых рецепторов вообще является наличие внеклеточного N-конца и внутриклеточного С-конца , семи трансмембранных спиралей (ТМ), трех внеклеточных (е1-3) и трех внутриклеточных петель (i1-3) (см. рис. 10).

G-белки – это семейство белков, относящихся к GTPазам и функционирующих в качестве вторичных посредников во внутриклеточных сигнальных каскадах. G-белки названы так, поскольку в своём сигнальном механизме они используют замену GDP на GTP как молекулярный функциональный «выключатель» для регулировки клеточных процессов.

G-белки делятся на две основных группы:

Ø «большие» гетеротримерные – это белки с четвертичной структурой , состоящие из трех субъединиц:

ü альфа(α),

ü бета (β),

ü гамма (γ)

Ø «малые» – это белки из одной полипептидной цепи , они имеют молекулярную массу 20-25 кДа и относятся к суперсемейству Ras (малые G-белки, регулируют деление клеток) малых GTPаз. Их единственная полипептидная цепь гомологична α-субъединице гетеротримерных G-белков.

Обе группы G-белков участвуют во внутриклеточной сигнализации.

Основной механизм сигнального действия G-белков. G-белок состоит из трех полипептидов:

ü α-субъединица, соединена с молекулой GTP и гидролизует ее,

ü β- и γ-субъединицы образуют димер, плотно соединенный нековалентными связями.

При соединении α-субъединицы с молекулой GDP и с βγ-субъединицами образуется неактивный тример , который прикрепляется к С-концевому участку рецептора. Связывание лиганда с этим рецептором приводит к изменению конформации цитоплазматического домена рецептора. Конформация α-субъединицы также изменяется, при этом ее сродство к GDP снижается, и GDP отщепляется от активного участка α-субъединицы .

GTP быстро связывается с активным участком, поскольку его внутриклеточная концентрация приблизительно в 10 раз превышает концентрацию GDP. После связывания GTP α-субъединица принимает активную конформацию и отщепляется как от рецептора, так и от βγ-субъединицы. GTP-связанная α-субъединица активирует различные эффекторные молекулы (например, аденилатциклазу, образующую сАМР). α-субъединица остается в активном состоянии до тех пор, пока входящая в ее состав GTPaзa не гидролизует GTP до GDP . Сразу после гидролиза GTP α- и βγ-субъединицы вновь соединяются и возвращаются к рецептору. Основные этапы этого процесса представлены на рис. 11.

Раньше считалось, что только α-субъединица G-белка взаимодействует с эффектором, а βγ-комплекс либо совсем не участвует в этом процессе, либо действует как отрицательный регулятор. Сейчас известно, что βγ-субъединица также может активировать эффекторные молекулы (например, мускариновые К + -каналы). Таким образом, и α-субъединица, и βγ-комплекс участвуют в регуляции клеточного ответа.

Эффекторные молекулы, взаимодействующие с G-белками. G-белки играют ключевую роль в активации каскада эффекторных молекул. К основным эффекторным молекулам, контролируемым G-белками, относятся:

ü аденилатциклаза

ü фосфолипаза С (PLC)

ü фосфолипаза А 2 (PLA2)

ü фосфоинозитид-3-киназа (РI 3 -киназа)

ü киназа β-адренорецептора (PARK)

Хотя в регуляции участвуют и α-субъединица, и βγ-комплекс, механизм регуляции специфичен для каждого эффектора. Например, существуют несколько различных форм аденилатциклазы. Каждая форма этой эффекторной молекулы активируется различными субъединицами G-белка: либо α, либо βγ, либо обеими субъединицами.

Физиологическая роль рецепторов, сопряженных с G-белками. Рецепторы, связанные с G-белками вовлечены в широкий круг физиологических процессов. Вот некоторые примеры:

1. зрение: опсины используют реакцию фотоизомеризации для превращения электромагнитного излучения в клеточные сигналы. Родопсин, например, использует превращение 11-цис-ретиналя в полностью-транс-ретиналь для этой цели

2. обоняние: рецепторы обонятельного эпителия связывают пахучие вещества (обонятельные рецепторы) и феромоны (вомероназальные рецепторы)

3. регуляция поведения и настроения: рецепторы в мозге млекопитающих связывают несколько различных нейромедиаторов, включая серотонин, дофамин, гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК) и глутамат

4. регуляция активности иммунной системы и воспаления: хемокиновые рецепторы связывают лиганды, которые осуществляют межклеточную коммуникацию в иммунной системе; рецепторы, такие как гистаминовый рецептор, связывают медиаторы воспаления и вовлекают определенные типы клеток в воспалительный процесс

5. функционирование вегетативной нервной системы: как симпатическая, так и парасимпатическая нервная система регулируются посредством рецепторов, связанных с G-белками, ответственных за многие автоматические функции организма, такие как поддержание кровяного давления, частоты сердечных сокращений и пищеварительных процессов

Усиление в каскадах передачи сигналов. В течение краткого периода своей активности аденилатциклаза производит несколько сотен молекул цАМФ (рис. 12). После того, как произведенные молекулы цАМФ активируют протеинкиназу А, она фосфорилирует и активирует фермент гликогенфосфорилазу, которая расщепляет гликоген до глюкозо-1-фосфата. Протеинкиназа А фосфорилирует также гликогенсинтазу, что приводит к ингибированию ее активности и, таким образом, предотвращает преобразование освобожденной глюкозы в гликоген. Эти два эффекта вместе обеспечивают мобилизацию глюкозы через расщепление гликогена, запасенного в печени.

В этом каскаде происходит огромное усиление сигнала. Одна молекула адреналина может вызвать активацию сотен α субъединиц G белков. Каждая из них в свою очередь будет активировать аденилатциклазу, которая в свою очередь синтезирует сотни молекул цАМФ. цАМФ активирует протеинкиназу А, которая модифицирует сотни молекул-мишений в клетке.

Сигнальные G-белки являются универсальными посредниками при передаче гормональных сигналов от рецепторов клеточной мембраны к эффекторным белкам , вызывающим конечный клеточный ответ.

Они являются объектом интенсивного изучения в связи с их участием во многих важных физиологических процессах (см. обзоры Gilman, 1987 ; Neer, Clapham, 1988 ; Freissmuth et al.,1989 , Кухарь В.П. ea, 1992). G-белки, участвующие в передаче сигнала, являются членами большого надсемейства гуанин-связывающих белков. G- белки - это прецизионные регуляторы, включающие или выключающие активность других молекул.

Связывание агониста (гормона, нейромедиатора и др.) с соответствующим рецептором приводит к белок-белковому взаимодействию между рецептором и G-белком и ускоряет диссоциацию ГДФ. В результате образуется короткоживущий комплекс агонист - рецептор - G-белок, не связанный ни с каким нуклеотидом. Связывание с этим комплексом молекулы ГТФ снижает сродство рецептора к G-белку, что приводит к диссоциации комплекса и высвобождению рецептора. Потенциально рецептор может активировать большое количество молекул G-белка, обеспечивая, таким образом, высокий коэффициент усиления внеклеточного сигнала на данном этапе. Активированная альфа-субъединица G-белка (альфа* ГТФ Мg). [ Bourne, ea 1997 ] диссоциирует от бета-гамма-субъединиц и вступает во взаимодействие с соответствующим эффектором, оказывая на него активирующее или ингибирующее воздействие.

Альфа-субъдиница с присоединенным с ней ГТФ способна взаимодействовать с эффектором в мембране - ферментами, такими, как аденилатциклаза , или, возможно, ионными каналами . Фермент может активироваться или ингибироваться, а ионный канал - открываться или закрываться. Конкретные примеры будут рассмотрены в последующих главах. Взаимодействие с эффектором, однако, длится до тех пор, пока альфа- субъединица, являющаяся ГТФ-азой, удерживает ГТФ. Так что, очень вскоре присоединенный ГТФ гидролизуется до ГДФ. Когда это происходит, альфа- субъединица снова меняет свою коонформацию и теряет способность активировать эффектор. После этого альфа-ГДФ взаимодействует с бета- гамма-комплексом и снова образует тримерный комплекс, завершая, таким образом, цикл ( рис. 1.9). Предполагают также, что комплекс из бета-гамма-субъединиц тоже может (прямо или опосредованно) влиять на эффекторные фермент ы.

Впоследствии ГТФ, связанный с альфа-субъединицей G-белка, подвергается гидролизу, причем ферментом, катализирующим этот процесс, является сама альфа-субъединица . Это приводит к диссоциации альфа-субъединицы от эффектора и реассоциации комплекса альфаГДФ с бета-гамма-субъединицами. Спонтанная активация G-белка, связанного с ГДФ - весьма маловероятный процесс.

Этот же механизм лежит в основе гормональной регуляции фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С ( Boyer et al., 1989) и фосфолипазы А 2 ( Axelrod et al., 1988). Кроме того, было показано, что G белки могут непосредственно активировать ионные каналы ( Sternweis, Pang, 1990). см. также:

Лимитирующей стадией процесса восстановления исходного состояния G-белка является скорость диссоциации GDP от альфа-субъединицы G-белка. Скорость диссоциации увеличивается при взаимодействии G-белок-GDP с агонист-связанным рецептором [ Branot D.R.,1986 ]. Связывание GTP G-белком приводит, очевидно, к образованию комплекса агонист-рецептор-G-белок. Аналог GTP-CTP-гамма-S и Mg 2+ усиливает диссоциацию альфа-субъединицы из тримера G-белка [ Northup J.V.,1983 ]. Однако следует заметить, что каталитическая субъединица аденилатциклазы из мембран мозга быка хроматографически соочищается с альфа- и бета-субъединицами G S -белка [ Marbach J.,1990 ] и вопрос диссоциации альфа-субъединиц из тримера G-белка для активации эффектора требует уточнения.

G-белки проявляют значительный полиморфизм. Каждая из форм субъединиц G-белка высокогомологична по структуре, близка по функциям, но отличается молекулярной массой и электрофоретической подвижностью [ Перцева М.Н.,1990 ]. Особенно широк полиморфизм и наиболее изучен для альфа s и альфа i G-белков. Так из мозга человека выделено 11 форм сДНК, ответственных за синтез альфа s субъединиц, четыре вида которых клонированы и, предполагается, что они определяют синтез четырех изоформ альфа s в мозге человека [ Bray P.,1986 ]. Для альфа i найдены, в основном, три изоформы альфа i 1, альфа i 2, альфаi 3 . Молекулярные массы изоформы альфаs находятся в пределах 42-55 кДа, а альфаi -39-41 кДа [ Перцева М.Н.,1990 ]. Распределение молекулярных вариантов альфаi носит тканеспецифический характер: альфа i 1 представлена, в основном, в мозге, альфа i 2 обнаружена в нервной ткани и в клетках крови, альфаi 3 представлена в переферических тканях и отсутствует в мозге [ ; Itoh I.,1988 ]. Что касается изоформ альфа-субъединиц G s -белков, то пока неясно, кодируются ли изоформы разными структурными генами или это продукт одного гена с последующим внутренним альтернативным сплайсингом исходного РНК-транскрипта [ Robishaw J.D.,1986 ], или множественность их результат посттрансляционной модификации [ Casey P.J.,1988 ]. В настоящее время известно 9 структурных генов, кодирующих C-белки и 12 продуктов этих генов [

(англ. Guanine nucleotide-binding proteins, белки, связывающие гуанилови нуклеотиды) — это семья белков, участвующих в клеточном сигналюванни эукариот. G-белки играют роль своеобразных переключателей: они могут переходить из неактивного состояния в активное и наоборот, соответственно включая или выключая передачу определенного сигнала внутри клетки. Свое название эти белки получили за способность связывать гуанилови нуклеотиды (англ. G uanine nucleotide): в комплексе с гуанозиндифосфатом (ГДФ) они являются неактивными, а в комплексе с гуанозинтрифосфат (ГТФ) — активные.

Термин «G-белки» чаще употребляется для обозначения гетеротримерних (больших) ГТФ-связывающих белков, состоящих из трех субъединиц α, β и γ; существует еще один класс ГТФ-связывающих белков — мономеры, которые иногда называют малыми G-белками (суперродина Ras малых ГТФаз), они гомологичные к α-субъединицы больших.

Гетеротримерни G-белки участвуют в передаче сигналов от рецепторов, сопряженных с G-белками (англ. G-protein coupled receptors, GPCR) — крупнейшего класса клеточных рецепторов (например, в Caenorhabditis elegans их гены занимают 5% всего генома). У позвоночных животных они отвечают за восприятие клеткой ряда гормонов и других сигнальных молекул, а также за химическое чувств (обоняние и вкус) и фоторецепции (зрение). Показательно, что примерно половина известных фармацевтических препаратов действуют через рецепторы, сопряженные с G-белками: среди таких есть и известные медикаменты, например антигистамины Кларитин (лоратадин) и антидепрессант Прозак (Флуоксетин), а также психотропные вещества, в частности героин, кокаин и тетрагидроканнабинол (действующее вещество марихуаны).

Гетеротримерни G-белки были открыто Альфредом Гилман и Мартином Родбеллом, за что в 1994 году они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Струкрутра гетеротримерних G-белков

Гетротримерни G-белки состоят из трех субъединиц: α, β и γ. α-субъединица содержит домен связывания и гидролиза ГТФ, что является идентичным для всей суперродины ГТФаз. В состав β-субъединицы входит 7 β-структур, организованных как лопасти пропеллера. С β-субъединицей тесно взаимодействует γ-субъединица, вместе они образуют единую функциональную структуру, которая может диссоциировать только в случае гидролиза белка. Весь G-белок заякорена в мембране с помощью двух липидов, один из которых ковалентно присоединен к N-конца α-субъединицы, другой к C-конца γ-субъединицы.

Рецепторы, сопряженные с G-белками

Рецепторы, сопряженные с G-белками (англ. G-protein coupled reseptors, GPCR) — крупнейшая семья клеточных рецепторов эукариот, обеспечивающих восприятие гормонов, нейромедиаторов, локальных регуляторов, а также обеспечивают зрение, обоняние и чувство вкуса позвоночных животных. В геноме человека найден около 700 генов GPCR, а в мыши за один только обоняние ответ более 1000 этих рецепторов.

Сигнальные молекулы, выступают лигандами для рецепторов, сопряженных с G-белками, могут быть очень разными по химической природе: белками, небольшими пептидами, липидами, производными аминокислот и тому подобное. Кроме этого некоторые предсатвникы этого класса рецепторов, в частности родопсин, могут воспринимать фотоны света. Иногда для одной сигнальной молекулы существует несколько различных GPCR, экспрессируются в различных типах клеток и запускают различные сигнальные пути. Например, в организме человека существует как минимум 9 различных рецепторов к адреналину и не менее 14 — до нейромедиатора серотонина.

Все рецепторы, сопряженные с G-белками, имеют похожую структуру: они состоят из одной полипептидной цепи, 7 раз пересекает липидный бислой. Каждый трансмембранный домен представлен α-спирали, в состав которой входит 20-30 неполярных аминокислот. Эти домены соединены между собой петлями различной величины, расположенными по обе стороны плазматической мембраны. GPCR преимущественно являются гликопротеинами, углеводные остатки которых расположены на зовнишьноклитинний стороне. Внутриклеточные домены этих рецепторов содержат сайты взаимодействия с G-белками.

Функциональный цикл G-белков

G-белки выполняют роль сопряжения клеточных рецепторов с определенными эффекторными молекулами, такими как ферменты или ионные каналы, при этом они выступают в качестве молекулярных переключателей. В неактивном состоянии G-белки содержат ГДФ, связанный с α-субъединицей.

Передача сигнала начинается тогда, когда на клеточный рецептор действует соответствующий лиганд, в результате чего рецептор активируется и меняет конформацию. Активированный рецептор влияет на G-белок (который или находится с ним в постоянном комплексе, или ассоциирует после активации), из-за чего структура α-субъединицы меняется таким образом, что она высвобождает связанную молекулу ГДФ. Место этой молекулы быстро занимает ГТФ, это приводит к аткивации G-белка и изменений в его структуре: α-субъединица теряет сродство к βγ-комплекса, и он распадается. В таком активированном состоянии как ГТФ-связанная α-субъединица, так и βγ-комплекс, могут осуществлять передачу сигнала: активировать определенные ферменты или влиять на состояние ионных каналов. α-субъединица является ГТФазою, и как только она гидролизует присоединен ГТФ до ГДФ, сразу же инактивируется, и триммера структура G-белка восстанавливается. Таким образом происходит отключение звука. Инактивированный G-белок может взаимодействовать с последующей молекулой рецептора и снова включаться.

Регуляция активности G-белков

Эффективность передачи определенного сигнала через G-белок зависит от соотношения между концентрацией активного, ГТФ-связанной, и неактивной, ГДФ-связанной форм. А это соотношение в свою очередь зависит от двух констатирует: константы диссоциации ГДФ, и константы скорости гидролиза ГТФ:

Где

• G-protein · GTP — концентрация активной формы G-белка;
• G-protein · GDP — концентрация неактивной формы G-белка;
• k diss, GDP — константа диссоциации ГДФ;
• k cat, GTP — константа скорости гидролиза ГТФ.

Такое соотношение подтверждается при избытке ГТФ в среде, а также его быстрого, фактически моментального, связывание с «пустой» молекулой G-белка (то есть не связанной с одним гуаниловый нуклеотидом). В таком случае эффективность передачи сигнала может регулироваться одним из следующих способов:

• Увеличение k diss, GDP, что обеспечивается специальным белками — факторами обмена гуаниловый нуклеотидов (англ. Guanine nucleotide exchange factors, GEFs), способствует интенсификации передачи сигнала. Для гетеротримерних G-белков такими факторами являются активированные рецепторы (GPCR), связанные с соответствующим лигандом.
• Уменьшение k diss, GDP, что обеспечивается ингибиторами диссоциации гуаниловый нуклеотидов (англ. Guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDI). Белки с такими функциями пока найдены для Ras-суперродины малых ГТФаз, их функция заключается в поддержании в цитоплазме постоянного пула неактивированных молекул, связанных с ГДФ;
• Увеличение k cat, GTP, то есть скорости гидролиза ГТФ, осуществляется благодаря ГТФаза-активирующим белкам (англ. GTPase activating proteins, GAPs). Таким образом снижается продолжительность жизни активированных молекул G-белков. Активность GAPs обычно регулируется другими сигнальными путями. Белки, ускоряют гидролиз ГТФ α-субъединицей гетеротримерних G-белков, называются регуляторы сигналювання G-белков (англ. Regulator of G protein signaling, RGS), в геноме человека есть около 25 генов RGS, каждый из которых взаимодействует с характеринм набором G- белков.

Сигнальные пути, активируются G-белками

G-белки получают входной сигнал от ассоциированных с ними рецепторов, после чего они активируют один из сигнальных путей клетки.

Влияние на синтез циклического АМФ

Циклический АМФ (цАМФ) — это распространенный вторичный посредник, контролирует многие процессы в эукариотических клетках. цАМФ синтезируется с АТФ большим трансмембранным ферментом аденилатциклазы, а разлагается цАМФ-фосфодиэстеразой. Многие сигнальных молекул влияют на клетку путем увеличения или уменьшения концентрации цАМФ через активацию или подавление аденилатциклазы. цАМФ осуществляет свою функцию вторичного посредника активируя цАМФ-зависимой протеинкиназы (протеинкиназу А, ПКА), которая в свою очередь фосфорилирует по остаткам серина и треонина много белков в клетке, активируя или деактивуючы их.

Существует два типа G-белков, влияющих на активные аденилатциклазы: G s (англ. Stimulatory) — стимулирующий, активирующий ее и увеличивает концентрацию цАМФ и G i (англ. Inhibitory) — ингибирующее, подавляющее аденилатциклазу, но также действует путем прямого воздействия на ионные каналы. Примерами реакций, запускаемых путем G s зависимого увеличение концентрации цАМФ, являются:

• Синтез и секреция тиреоидных гормонов щитовидной железой под влиянием тиреотропного гормона;
• Секреция кортизола корой надпочечников под влиянием адренокрортикотропного гормона;
• Расщепление гликогена в мышцах под воздействием адреналина;
• Расщепление гликогена в печени под влиянием глюкагона;
• Увеличение частоты и силы сердечных сокращений под влиянием адреналина;
• Реабсорбция воды в почках под влиянием паратгормона;
• Расщепление триглицеридов в жировой ткани под влиянием одного из насутпних гормонов: адреналина, АКТГ, глюкагона, тиреотропного гормона.

Бактериальные токсины, влияющие на активность белков G s и G i

G-белки, влияющие на цАМФ-зависимое клеточное сигналювання, являются мишенями действия бактериальных токсинов:

• Холерный токсин — это фермент, который катализирует перенос АДФ-рибозы с НАД + (АДФ-рибозилирования) на α-субъединицы G s -билка. В результате он теряет возможность гидролизовать связанную молекулу ГТФ и переходит в состояние перманентной активации. Это в свою очередь приводит к длительному повышению концентрации цАМФ в клетках стенки толстого кишечника, из-за чего в его просвет начинает выделяться большое количество воды и ионов Cl -. Таким образом и возникает диарея, является характерным признаком заболевания холерой.
• Токсин коклюша осуществляет АФД-рибозилирования α-субъединицы G i -билка, из-за чего она не может взаимодействовать с соответствующим рецептором и включаться.

Эти два токсины используются в биологических исследованиях, чтобы определить определенная клеточный ответ опосредуется G s — или G i -билком.

Активация фосфолипазы С-β

Много рецепторов, сопряженных с G-белками действуют путем активации фосфолипизы С-β (ФЛC-β). Этот фермент действует на инозитоловий фосфолипид: фосфатидилинозитол-4,5 бифосфат (ФИ (4,5) Ф2 или ФИФ 2), присутствует в небольшом количестве во внутреннем листке липидного бислоя плазматической мембраны. Рецепторы, активирующие этот сигнальный путь, обычно сопряженные с G q -билком, активирующий фосфолипазу С аналогично как G s -билок — аденилатциклазу. Активирована фосфолипаза расщепляет фосфатидилинозитол-4,5 бифосфат к инозитол-1,4,5-трифосфата (ИФ 3) и диациглицеролу (ДАГ). На этом этапе сигнальный путь разветвляется:

• ИФ 3 от плазматической мембраны диффундирует в цитозоль, где впоследствии присоединяется к кальциевых каналов на поверхности эндоплазматического ретикулума и открывает их. Это приводит к резкому увеличению концентрации ионов Ca + в цитоплазме. Эта молекула также является важным вторичным посредником и регулирует многие клеточных процессов.
• ДАГ остается встроенным в мембрану, где может быть субстратом для синтеза эйкозаноидов, в том числе простагландинов, участвующих в ощущении боли и воспалительных процессах. Также ДАГ активирует серин / треониновых протеинкиназу С, активность которой также зависит и от кальция.

Примерами клеточных реакций G-белок-зависимой активации фосфолипазы C-β являются:

• Расщепление гликогена в печени под влиянием вазопрессина;
• Секреция амилазы поджелудочной железой под влиянием ацетилхолина;
• Сокращение гладких мышц под влиянием ацетилхолина;
• Агрегация тромбоцитов под влиянием тромбина.

Регуляция ионных каналов G-белками

Многие G-белков действуют путем открытия или закрытия ионных каналов, таким образом изменяя электрические свойства плазматической мембраны.

Например снижение частоты и силы сердечных сокращений под влиянием ацетилхолина происходит благодаря тому, что мускариновых ацетилхолиновых рецепторов после активации взаимодействует с G i -билком, α-субъединица которого подавляет деятельность аденилатциклазы, в то время как βγ-комплекс открывает калиевые каналы в плазматической мембране клеток сердечной мышцы, из-за чего их возбудимость уменьшается.

Другие G-белки регулируют активность ионных каналов косвенно: например рецепторы зрения и обоняния действуют через G-белки, которые влияют на синтез циклических нуклеотидов, в свою очередь закрывают или открывают ионные каналы (ионные каналы управляемые циклическими нуклеотидами). Например, все обонятельные рецепторы сопряжены с G olf -билком, который активирует аденилатциклазу; цАМФ, синтезируемый, открывает натриевые каналы, что приводит к деполяризации мембраны и генерирования нервного импульса (рецепторного потенциала), который передается нейронам.

В палочках сетчатки глаза человека светочувствительной молекулой является родопсин. Плазматическая мембрана этих клеток содержит большое количество цГМФ-управляемых катионных каналов. При отсутствии стимуляции светом цитоплазма палочек содержит высокое количество цГМФ, что удерживает катионные каналы в открытом состоянии. В результате мембрана периодически деполяризуется и происходит синаптическая передача импульсов нейронам. После активации светом родопсин меняет конформацию и взаимодействует с G-белком трансдуцином (G t). После этого его α-субъединица активирует цГМФ-фосфодиэстеразу, которая расщепляет цГМФ, в результате чего закрываются катионные каналы и синаптическая передача прекращается. Именно уменьшение частоты импульсов, поступающих от светочувствительных клеток, воспринимается мозгом как ощущение света.

Семьи G-белков

Все гетеротримерни G-белки разделяют на четыре основные семьи по аминокислотной последовательности α-субъединицы:

Основные семьи гетеротримерних G-белков на основе аминокислотной последовательности α-субъединицы
Семья	Некоторые члены	Субъединица, отвечающий за эффект	Некоторые функции
I	G s	α	Активация аденилатциклазы, открытие кальциевых каналов
G olf	α	Активация аденилатциклазы в обонятельных нейронах
II	G i	α	Ингибирование аденилатциклазы
βγ	Открытие калиевых каналов
G o	βγ	Открытие калиевых каналов, закрывания кальциевых каналов
α и βγ	Активация фосфолипазы С-β
G t (трансдуцин)	α	Активация цГМФ-фосфодиэстеразы в фоторецепторах позвоночных
III	G q	α	Активация фосфолипазы С-β
IV	G 12/13	α	Активация мономерных ГТФаз семьи Rho, регулирующих актиновом цитоскелет